近日，中山大學中山眼科中心教授張秀蘭團隊與劍橋大學教授Patrick Yu-Wai Man合作，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術靶向敲除碳酸酐酶2（Car2）基因，在小鼠模型上單次給藥獲得持續降低眼壓兩個月以上的顯著作用，為青光眼提供了廣譜、長效降低眼壓基因治療的可能性。相關成果發表于《細胞報道醫學》。
“我們打破了傳統基因治療研究框架，從臨床實際需求出發，尋找到適合所有青光眼類型的Car2基因進行廣譜基因治療研究。”論文共同通訊作者張秀蘭表示，該研究成果具有極大的臨床轉化潛力，基因編輯藥物有望替代傳統藥物治療手段，實現“One shot gene therapy——單次給藥，長效降壓”的目標，為所有類型的青光眼患者減輕疾病負擔。
青光眼是全球范圍內第一大不可逆致盲性眼病。基因編輯能夠提供單次干預、長效治療的可能，是青光眼理想的治療工具。張秀蘭團隊歷經3年多時間的潛心研究，從臨床降眼壓藥物的作用機制出發，尋找到適合所有青光眼類型的Car2基因進行廣譜基因治療研究，利用CRISPR-Cas9技術敲除Car2基因，通過單次玻璃體腔注射，在小鼠模型中獲得長達兩個月的降眼壓效果，為青光眼提供了廣譜基因療法的可能性。
張秀蘭團隊首先針對小鼠Car2基因設計了六條sgRNA序列，并在體外利用T7E1實驗結合深度測序技術評估各sgRNA的基因編輯效率。為了進一步提高基因編輯效率，團隊篩選出兩條sgRNA并構建雙靶點CRISPR系統，結果表明基因編輯效率被顯著提升至97.3%。接著，為了驗證Car2基因敲除是否能夠降低眼壓，該團隊將雙靶點CRISPR系統包裝至ShH10血清型的腺相關病毒（AAV）載體中。ShH10-AAV對負責房水生成的睫狀體組織有很高的親和性。通過單次玻璃體腔注射，團隊證明雙靶點CRISPR系統能夠靶向睫狀體組織，減少CAR2蛋白的表達。眼壓監測結果也表明Car2基因敲除能夠顯著降低正常小鼠的基線眼壓，相較于對照組減少約3mmHg，并且持續兩個月以上。
為了進一步探索Car2基因敲除對青光眼的治療效果，研究團隊采用了DBA/2J小鼠和磁珠誘導慢性高眼壓模型兩種實驗性青光眼模型。結果表明Car2基因敲除能夠顯著降低青光眼模型小鼠的眼壓，并且能夠延緩甚至阻止高眼壓帶來的組織學損傷。此外，在慢性高眼壓模型中，以臨床常用降眼壓藥物派立明（布林佐胺）滴眼液作對比，發現Car2基因敲除降眼壓效果要略優于派立明，該發現極大促進了基因編輯藥物替代傳統藥物治療青光眼的可能性。
盡管眼球憑借“免疫豁免”是理想的基因治療靶器官，但由于AAV病毒缺乏組織特異性，無法避免視網膜的轉染，因此張秀蘭團隊通過組織學和功能學評估Car2基因敲除的安全性和潛在副作用。OCT以及ERG結果表明，Car2基因敲除未引起潛在的不良反應。
